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BRDU對研究細胞動力學有著重要意義

Brdu是一種合成的胸苷類似物，在DNA復制的S期可替代胸腺嘧啶核苷選擇性結合到細胞DNA中。從而檢測細胞DNA合成和標記細胞分裂，凋亡等行為。在遺傳研究中Brdu可通過活體注射或細胞培養添加，然后使用抗Brdu的單克隆抗體進行特異性標記，ICC或IHC法染色顯示增殖細胞。另外，還能同時結合其它細胞標記物，雙重染色，來判斷增殖細胞的種類，增殖速度等，對研究細胞動力學有著重要意義。

使用方法

1. Brdu配制

用1X DPBS充分溶解適量的Brdu配置成濃度為10 mg/ml的母液，0.22um濾器過濾除菌后，按照0.5ml/管的量分裝放在-20℃或者-80℃長期保存，避免反復凍融。Brdu儲存液再融化后，4℃可穩定存放一周。

2. 在體Brdu標記

腹腔注射法（常用）：無菌的10 mg/ml（溶于DPBS）適合用于體內注射用。按照100-200μl（1-2 mg）Brdu的量腹腔注射到小鼠體內。注意：一般注射后0.5 h后在小腸、胸腺和骨髓瘤處就能檢測到Brdu。在注射后24 h內幾乎所有組織都能檢測到Brdu。根據自身的實驗體系，在合適的時間點處死動物，摘除待研究的組織。使用冰凍切片或者石蠟包埋的方法進行組織處理和切片制備。然后進入后續的IHC染色步驟。

3. 體外Brdu標記（培養原代細胞或者細胞系）

推薦使用濃度：10 μM Brdu（稀釋于培養液）

1）在96孔板上按標準步驟進行細胞培養；

2）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液。然后取10μl  1 mM Brdu溶液直接加入1 ml培養液即得到10 μM  Brdu工作液。

3）按100 μl/孔Brdu工作液的量進行細胞標記，37℃孵育60 min~過夜。同時設置非Brdu標記的細胞作為陰性對照。注意：最佳的孵育時間取決于細胞增殖速度以及需要達到的實驗目的。比如，對于快速增殖細胞（如HL-60）有效孵育時間為30-45min；對于原代細胞（如未受外源刺激培養的外周血淋巴細胞）孵育時間可能需要24 h。細胞密度需小于2x106 /ml。

4）制備單細胞層玻片，使用以下任何一種方法：

a.細胞離心涂片制備：使用細胞離心涂片機，將100μl標記好的細胞（濃度為：1-2x106 /ml）直接離心poly-L-lysinee包被的玻片上，風干。

b.細胞涂片制備：取一小滴標記好的細胞懸液于poly-L-lysine包被玻片的一端，然后用第二個干凈玻片將其均勻涂布成一薄層。室溫風干。

5）將玻片置于70%冰乙醇放在-20℃下固定20-30 min。

6）PBS清洗細胞3次，每次5min。

7）加入1.5M HCl中室溫孵育30 min。注意：DNA的變性對于Brdu染色的成功至關重要。

8）吸去HCl，PBS清洗2次，每次5min。

9）進入后續ICC染色步驟。

4. 體外Brdu標記（組織薄片）

1）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 -20μl 1 mM Brdu溶液直接加入1 ml組織培養液即得到最終工作液。確保有足夠的工作液（37℃溫熱）*浸泡組織。

2）在溫熱的培養基內進行組織切片，注意維持組織的活力。

3）轉移組織薄片至預裝有10 ml Brdu標記液的15 ml離心管內。置于37℃，CO2 培養箱內孵育。孵育時間取決于組織薄片類型以及需要達到的實驗目的（常用的為2-4 h）。

4）37℃ PBS清洗組織薄片，每次5 min。

5）使用標準的冰凍切片或者石蠟包埋切片的方法固定組織并進行后續其它染色標記。