食品中大腸菌群的檢測方法！
一、何為食品中大腸菌群?
大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非*一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調(diào)查研究表明，大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)常活動的場所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。 大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。
糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在(如沙門氏菌、志賀氏菌等)，因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。 大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。
二、食品大腸菌群檢驗方法：
由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。
目前國內(nèi)采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測程序上略有不同。
(一)國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。
乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。
分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。 證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。
報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml(g)大腸菌群的MPN值。
具體操作參見GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定》
(二)原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進行檢測。本方法采用兩步法：
推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。
證實試驗：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。
具體操作參見 SN0169-92 《中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》
三、說明：
1.MPN檢索表：
MPN 為大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列進行稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)近似的數(shù)值。
MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。注意國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結(jié)果報告單位也不相同。
2.初發(fā)酵和證實試驗：
無論是國家標(biāo)準(zhǔn)的三步法還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進行了兩次發(fā)酵試驗，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。
3.產(chǎn)氣量與倒管：
在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡(有時比小米粒還小)，有時可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進一步試驗。
4.挑選菌落：
國家標(biāo)準(zhǔn)中，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離，對典型和可疑菌落進行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時，檢出率高;紅色、粉紅色菌落檢出率較低。
另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個菌落，由于機率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。5.抑菌劑：
大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基*、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。
國家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基*作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。
抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有誤差，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響，因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行。
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